Il ciclo della trascrizione nei batteri

Il core della RNA polimerasi batterica è in grado, in linea di principio, di iniziare la trascrizione in qualsiasi punto della molecola di DNA. Nelle cellule, però, la polimerasi inizia la trascrizione solo dai promotori. È l'aggiunta di un fattore d'inizio, chiamato σ, che converte l'enzima core nella forma che è in grado di iniziare solo dai promotori. Questa forma completa dell'enzima è chiamata RNA polimerasi oloenzima. Nel caso di E.coli, il fattore σ predominante è chiamato σ70 che riconosce promotori con le seguenti caratteristiche: due sequenze conservate, ciascuna di sei nucleotidi, separate da un frammento non specifico di 17-19 nucleotidi. Le due sequenze specifiche sono centrate rispettivamente a circa 10 e 35 paia di basi a monte del sito in cui inizia la sintesi dell'RNA. Queste sequenze sono chiamate regioni o elementi -35 (minus 35) e -10 (minus 10). La funzione della sequenza -35 è quella di fornire il segnale per il riconoscimento da parte della RNA polimerasi, mentre la sequenza -10 permette al complesso di convertirsi dalla forma chiusa a quella aperta. Potremmo quindi considerare la sequenza -35 come un “dominio di riconoscimento” e la sequenza -10 come un “dominio di svolgimento” del promotore. Sebbene la maggior parte dei promotori σ70 contengano le regioni -35 e -10, le sequenze non sono identiche.  Infatti, confrontando i diversi promotori, è possibile derivare una sequenza consenso che rappresenta le regioni -10 e -35 più comuni, separate dallo spaziatore ottimale (17 paia di basi). Comunque, i promotori con la sequenza più vicina a quella consenso sono generalmente più “forti” di quelli con sequenze divergenti. Inoltre, in alcuni promotori forti, ad esempio quelli che dirigono l'espressione dei geni per gli rRNA, si trova un elemento addizionale di DNA che lega la RNA polimerasi. Si chiama UP-element (elemento UP) ed aumenta il legame della polimerasi, in quanto fornisce un'ulteriore interazione specifica tra l'enzima e il DNA. Un'altra classe di promotori σ70 non ha la regione -35, però possiede il così detto elemento -10 esteso. Il fattore σ70 può essere suddiviso in quattro regioni denominate σ 1-4. Le regioni che riconoscono gli elementi -10 e -35 del promotore sono rispettivamente la regione 2 e 4. Due eliche all'interno della regione 4 formano un dominio comune di legame al DNA, chiamato elica-giro-elica. Una di queste eliche si inserisce nel solco maggiore e interagisce con le basi della regione -35; l'altra elica si posiziona sulla sommità del solco ed entra in contatto con l'ossatura del DNA. Anche la regione -10 è riconosciuta da un'α elica. In questo caso però, l'interazione è molto meno caratterizzata e più complessa in quanto è proprio su questo elemento che avviene l'inizio della separazione del DNA durante la transizione tra complesso chiuso a quello aperto. Per questo motivo l'elica che è coinvolta nel riconoscimento della regione -10 contiene parecchi amminoacidi aromatici essenziali, che possono stabilizzare il DNA aperto. Contrariamente, agli altri elementi del promotore, l'elemento UP non viene riconosciuto da σ, ma da un dominio carbossiterminale della subunità α, chiamato αCTD, che è unito all'αNTD tramite una connessione flessibile.  Bisogna ricordare che oltre al fattore sigma, per rispondere a cambiamenti generali dell'ambiente, E.coli usa fattori sigma alternativi che prendono il nome o dal peso molecolare del prodotto o dal gene. Il fattore generale responsabile della trascrizione della maggior parte dei geni in condizioni normali è σ70, mentre i fattori alternativi σS, σ32, σE e σ54 sono attivi in risposta a cambiamenti ambientali.
Il legame iniziale tra l'RNA polimerasi e il promotore nel complesso chiuso lascia il DNA nella forma a doppia elica. Lo stadio successivo dell'inizio richiede che l'enzima sia legato in maniera più salda con il promotore, nel complesso aperto. La transizione dal complesso chiuso a quello aperto comporta dei cambi strutturali nell'enzima e l'apertura della doppia elica del DNA per liberare il filamento stampo da quello non stampo. Questa separazione avviene tra la posizione -11 e +3 rispetto al sito di inizio della trascrizione. Nel caso della polimerasi batterica non vi è bisogno dell'idrolisi dell'ATP ma è un cambio conformazionale spontaneo (isomerizzazione). Per avere un'idea dei cambi strutturali che accompagnano l'isomerizzazione, dobbiamo esaminare la struttura dell'oloenzima più in dettaglio. Come abbiamo detto, un canale corre tra le pinze dell'enzima a forma di chela di granchio. Il sito attivo dell'enzima, che è composto da regioni in entrambe le subunità β e β', si trova alla base delle pinze, all'interno del “solco centrale attivo”. Ci sono cinque canali nell'enzima. Il canale d'ingresso NTP-uptake, permette l'entrata dei ribonucleotidi verso il centro attivo. Il canale di uscita dell'RNA (RNA-exit) consente alla catena di RNA di lasciare l'enzima mentre è sintetizzato durante l'allungamento. I tre canali rimanenti permettono l'ingresso e l'uscita del DNA dall'enzima: il DNA a valle (ossia quello che si trova davanti l'enzima e che deve essere trascritto) entra nel solco centrale attivo nella forma a doppia elica, attraverso il canale del DNA a valle (DNA downstream). All'interno del solco centrale attivo, le catene di DNA si separano dalla posizione +3. Il filamento non stampo esce dal solco centrale attivo attraverso il canale NT (non template) e si sposta lungo la superficie dell'enzima. Il filamento stampo, invece, segue un cammino lungo il solco centrale attivo ed esce tramite il canale T (template). La doppia elica si riforma in posizione -11 nel DNA a monte, cioè dietro l'enzima. In seguito all'isomerizzazione dal complesso chiuso a quello aperto, si possono osservare due importanti cambiamenti strutturali dell'enzima: 1) le pinze anteriori si chiudono fermamente sul DNA a valle e 2) c'è uno spostamento consistente della regione N-terminale di σ che permette l'accesso del DNA nel sito attivo. Come abbiamo detto precedentemente, inoltre, il fattore sigma è coinvolto soltanto nell'inizio della trascrizione e non è presente quando si conclude l'inizio abortivo e la sintesi di RNA è iniziata con successo. Quando viene rilasciato dal nucleo dell'enzima, il fattore sigma diventa immediatamente disponibile per essere usato da un altro nucleo dell'enzima. Quest'ultimo ha un elevata affinità intrinseca per il DNA, che è aumentata dalla presenza di RNA nascente, ma la sua affinità per i siti di legame debole è troppo alta per permettere all'enzima di distinguere in modo efficiente i promotori dalle altre sequenze. Riducendo la stabilità dei complessi deboli, sigma permette al processo di avvenire molto più rapidamente e, stabilizzando l'associazione a livello dei siti di legame forte, il fattore spinge irreversibilmente la reazione verso la formazione di complessi aperti. Quando l'enzima rilascia sigma, ritorna ad un'affinità generale per tutto il DNA, indipendentemente dalla sequenza, adatta a continuare la trascrizione. Bisogna ricordare, che tutte le RNA polimerasi sono comunque debolmente al DNA.

L'importanza della separazione dei filamenti del DNA nella reazione di inizio è evidenziata dagli effetti sul superavvolgimento. Infatti, sia le RNA polimerasi procariotiche che eucariotiche possono iniziare la trascrizione in vitro quando lo stampo è superavvolto, presumibilmente perché la struttura superavvolta richiede meno energia per la fusione iniziale del DNA nel complesso d'inizio. Inoltre il superavvolgimento viene anche continuamente coinvolto nella trascrizione. Man mano che la RNA polimerasi trascrive il DNA si ha avvolgimento e svolgimento. Infatti, man mano che si spinge in avanti lungo la doppia elica, la RNA polimerasi genera superavvolgimento positivi (DNA avvolto più strettamente) davanti a sé e lascia superavvolgimenti negativi (DNA parzialmente svolto) dietro di sé. La trascrizione ha perciò un effetto significativo sulla struttura locale del DNA. Come risultato, gli enzimi girasi (che introduce superavvolgimenti negativi) e topoisomerasi I (che rimuove superavvolgimenti negativi) sono necessari per rettificare la situazione rispettivamente davanti e dietro la polimerasi. 
La trascrizione vera e propria, comunque, dall'RNA polimerasi che può iniziare una nuova catena di RNA su uno stampo di DNA e perciò non ha bisogno di un primer. Questa non facile impresa richiede che il ribonucleotide d'inizio venga portato nel sito attivo e tenuto saldamente legato allo stampo, mentre l'NTP successivo venga presentato nel corretto assetto affinché avvenga la reazione di polimerizzazione. Una volta che il ribonucleotide di inizio è entrato nel solco centrale attivo e comincia la sintesi di RNA, segue un periodo chiamato inizio abortivo. In questa fase, l'enzima sintetizza delle molecole di RNA corte, lunghe circa 10 nucleotidi o meno. Anziché essere allungati ulteriormente, questi trascritti vengono rilasciati dalla polimerasi e l'enzima, senza dissociarsi dallo stampo, inizia di nuovo la sintesi. Non è ancora chiaro il motivo di questo inizio abortivo ma si pensa che affinché si possa generare un RNA più lungo di 10 nucleotidi, una regione di σ che si trova all'inizio ad occupare il canale di uscita dell'RNA deve essere spostata per permettere successivamente l'allungamento. A questo punto, all'apertura del solco centrale attivo, le due catene di DNA si separano e seguono diversi cammini passando dall'enzima, prima di uscire lungo i rispettivi canali e si riassociano in doppia elica dietro la polimerasi che sta allungando. I ribonucleotidi entrano nel sito attivo per i loro canali e vengono aggiunti alla catena di RNA sotto la giuda del filamento stampo di DNA. Solamente otto o nove nucleotidi della catena di RNA rimangono accoppiati allo stampo in ogni determinato momento: il resto della catena di RNA si stacca e viene portata fuori dall'enzima attraverso il canale di uscita dell'RNA. La formazione del legame fosfodiesterico avviene per attacco idrofilico del gruppo 3' OH dell’ultimo nucleotide della catena sul gruppo fosfato a del NTP in entrata, con rilascio di una molecola di pirofosfato. Inoltre, l'RNA polimerasi svolge due funzioni specifiche di correzione. La prima è chiamata editing pirofosfolitico, in cui l'enzima usa il suo sito attivo per catalizzare la rimozione di un ribonucleotide errato tramite la reincorporazione di PPi, e quindi incorporare un altro ribonucleotide corretto al suo posto, e l'editing idrolitico, in cui la polimerasi torna indietro di uno o più nucleotidi e taglia l'RNA prodotto, rimuovendo le sequenze che contengono errori, per poi ripartire (quindi può fare una pausa).


Una volta che l'RNA polimerasi a iniziato la trascrizione, l'enzima si muove lungo lo stampo, sintetizzando RNA, fino a incontrare la sequenza di un terminatore. A questo punto l'enzima smette di aggiungere nucleotidi alla catena di RNA in crescita, rilascia il prodotto completato e si dissocia dallo stampo di DNA. Nei batteri i terminatori sono di due tipi: Rho-indipendenti e Rho-dipendenti. Il primo tipo fa terminare la polimerasi senza il coinvolgimento di altri fattori. Il secondo tipo, invece, ha bisogno di una proteina addizionale, chiamata Rho, per indurre la terminazione. Comunque, i terminatori Rho-indipendenti, detti anche terminatori intrinseci, sono costituiti di due elementi: una sequenza invertita (palindromica) corta (circa 20 nt), cui segue un piccolo segmento di circa otto coppie di basi A-T. Quando la polimerasi trascrive questo elemento invertito, l'RNA risultante può formare una struttura a cappio (stem-loop), detta anche “forcina”, grazie all'appaiamento intramolecolare di basi. Si pensa che la forcina provochi la terminazione attraverso la rottura del complesso di allungamento. Questa rottura avviene perché viene aperto a forza il canale di uscita dell'RNA nell'RNA polimerasi, oppure, secondo un altro modello, perché si interrompono le interazioni tra l'RNA e lo stampo. La forcina funziona da terminatore in maniera efficiente solo quando è seguita da un segmento di coppie di basi A:U. I terminatori Rho-dipendenti, invece, hanno degli elementi di RNA molto meno caratterizzati e perciò hanno bisogno dell'aiuto fornito dal fattore Rho. Quest'ultimo, è una proteina a forma di anello, costituita da sei subunità identiche, si lega all'RNA a singola elica appena questo esce dalla polimerasi. La proteina, oltre ad un attività elicasica, ha anche una attività ATPasica: una volte legata al trascritto, usa l'energia derivata dall'idrolisi dell'ATP per staccare l'RNA dallo stampo e dalla polimerasi. Inoltre, Rho ha una certa specificità nella sequenza a cui si lega. Questi siti ottimali consistono in una serie di 40 nucleotidi che non formano una struttura secondaria (cioè rimangono a singola elica) e contengono anche un buon numero di residui in C.