Distinzione macroscopica e microscopica

I batteri formano colonie. La somma delle loro caratteristiche conferisce alla colonia le sue peculiarità, quali colore, dimensione, forma e odore. L'aspetto al microscopio, compresa forma, grandezza e la capacità di trattenere la colorazione di Gram sono i principali mezzi per distinguere i batteri. Esistono cocchi (sferici), bacilli (a bastoncello), spirochete (a spirale) e forme derivate da queste. Esistono batteri che formano aggregati, ad esempio a grappolo d'uva, a diplococchi o a catenelle.

La colorazione di Gram è un test che consente di distinguere tra le due classi principali di batteri. Questi vengono fatti asciugare su un vetrino, fissati col calore e colorati con cristalvioletto. Si opera un lavaggio con il liquido di Lugol (a base di iodo-ioduro potassico) che reagisce con il colorante formando un composto liposolubile. Il tutto viene lavato con acqua e alcol. A questo punto:
i batteri gram-positivi hanno trattenuto il cristalvioletto, poiché l'alcool non ha danneggiato a sufficienza la spessa parete cellulare (idrofila) che non permette al colorante di passare.

I batteri gram-negativi sono grigiastri, privi di colorazione, questo perché l'alcool ha sciolto i lipidi della membrana esterna e danneggiato la sottile parete cellulare che non è più in grado di trattenere il complesso cristal violetto - ioduro (liposolubile).
Per far risaltare meglio la differenza si colora il materiale con un colorante di contrasto, in genere la safranina. Questa può penetrare solo nelle cellule decolorate poiché, anche se poco idrofila, è di dimensioni ridotte. Alla fine i gram-positivi saranno color violetto, mentre i gram-negativi color rosso.
I batteri non classificabili con la colorazione di Gram comprendono i micobatteri, che hanno una parete ricca di cere e lipidi e si possono osservare dopo colorazione di Ziehl-Neelsen, e i micoplasmi, che non hanno peptidoglicano.