Dati preliminari sulle alterazioni del colesterolo intracellulare nella malattia Alzheimer mediante metodi di imaging

Abstract
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colesterolo anche nelle cellule periferiche dei pazienti AD (i.e., fibroblasti cutanei e
linfomonociti).
Nel loro insieme i nostri risultati hanno dimostrato che nelle cellule di tessuti
periferici, da noi esaminati, dei pazienti AD è presente un accumulo intracellulare di
colesterolo sia libero che esterificato nella zona perinucleare, in accordo con quanto
osservato nelle cellule del SNC di soggetti AD [5].
Queste osservazioni sostengono l’ipotesi che l’alterazione dell’omeostasi del
colesterolo sia un fenomeno che coinvolge non solo le cellule del SNC ma anche le
cellule dei tessuti periferici dei pazienti AD, e propongono tali cellule come potenziale
modello per approfondire lo studio dei meccanismi citopatologici di AD, individuare nuovi
markers diagnostici e monitorare lo sviluppo della malattia come pure gli effetti di nuove
terapie.
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ELENCO DELLE PUBBLICAZIONI SEPARATE
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Questa tesi è basata sulle seguenti pubblicazioni:
I. Pani A, Mandas A, Diaz G, Abete C, Cocco PL, Angius F, Brundu A, Mucaka N, Pais
ME, Saba A, Barberini L, Zaru C, Palmas M, Putzu PF, Mocali A, Paoletti F, La Colla
P, Dessi S
Accumulation of neutral lipids in peripheral blood mononuclear cells as a distinctive
trait of Alzheimer patients and asymptomatic subjects at risk of disease.
BMC Med. 2009 Nov;7(1):66
II. A Pani, S Dessì, G Diaz, C Abete, C Mulas, C Norfo, F Angius, MD Cannas, CD Orru,
A Mocali, PL Cocco, P La Colla, P Putzu, F Paoletti
Altered cholesterol ester cycle in skin fibroblasts from patients with Alzheimer’s
Disease.
J Alzheimers Dis. 2009 Sep;18(4):829-41
III. Diaz G, Melis M, Batetta B, Angius F, Falchi AM
Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow
emission ratio.
Micron. 2008 Oct;39(7):819-24
IV. Diaz G, Batetta B, Sanna F, Uda S, Reali C, Angius F, Melis M, Falchi AM
Lipid droplet changes in proliferating and quiescent 3T3 fibroblasts.
Histochem Cell Biol. 2008 May;129(5):611-21
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INTRODUZIONE
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Il pathway del colesterolo
Il colesterolo è il precursore degli ormoni steroidei, degli acidi biliari e delle
vitamine essenziali, ma anche componente strutturale di tutte le membrane cellulari ove
ha il compito di regolarne la permeabilità e la fluidità. È, dunque, una molecola
fondamentale per la struttura e la funzione di tutte le cellule dei mammiferi, il cui
accumulo intracellulare come CL, però, è per loro potenzialmente dannoso a causa della
sua tossicità considerando anche che le cellule non possiedono sistemi enzimatici atti alla
sua degradazione.
Pertanto, è assolutamente necessaria la presenza di un turnover di colesterolo
nelle membrane di tutte le cellule dell’organismo che ne garantisca il suo equilibrio. Tale
equilibrio è assicurato dai meccanismi omeostatici del colesterolo che ne regolano la
biosintesi, l’uptake e l’efflusso cellulare, l’esterificazione come la formazione dei LD.
Poiché la distribuzione del colesterolo nella cellula è estremamente compartimentalizzata
(il 70-90% del colesterolo totale si trova nelle membrane plasmatiche), è plausibile che
quello in surplus rispetto alle esigenze cellulari sia rapidamente trasportato dalla
membrana al RE dove ricoprirebbe il ruolo di segnale regolatore per le proteine deputate
all’omeostasi che ivi risiedono. Quindi, il livello di colesterolo nel RE controllerebbe (i) la
produzione di colesterolo attraverso la sintesi endogena a partire dall’acetil-coenzima A
(acetil-CoA), (ii) l’internalizzazione delle low-density lipoprotein (LDL), (iii) la cessione ad
accettori esterni, in gran parte high-density lipoprotein (HDL), (iv) trasporto al RE, la sua
esterificazione ad opera dell’acil-coenzimaA-colesterolo: aciltransferasi (ACAT) e
formazione dei LD.
In definitiva, l’assetto lipidico intracellulare è finemente regolato ed alterazioni
di uno o più passaggi in questa via metabolica possono provocare od aggravare una
grande varietà di patologie, in particolare quelle legate al metabolismo del colesterolo.
Introduzione – Il pathway del colesterolo
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Biosintesi del colesterolo
La sintesi del colesterolo può avvenire in tutti i tessuti ma è prevalente in quelli
steroidogenici (i.e., surrene e ghiandole sessuali) per la produzione di ormoni steroidei e
nel fegato dove viene utilizzato per la sintesi di lipoproteine ed acidi biliari.
Il precursore della sintesi endogena del colesterolo è l’acetil-CoA, e l’enzima
chiave è il 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoenzymeA-reductase (HMGCoA-r) che, nel RE,
catalizza la trasformazione di HMG-CoA ad acido mevalonico. Attraverso questa via
metabolica sono prodotti, oltre al colesterolo, altri composti non sterolici (i.e., dolicolo,
ubichinone ed eme A) ed unità isoprenoidi a 15 (farnesil) e a 20 (geranil) atomi di
carbonio. Questi ultimi sono fondamentali per il funzionamento di proteine regolatrici
leganti il GTP, che in seguito a prenilazione, acquisiscono la capacità di ancorarsi alla
membrana determinando le modificazioni necessarie per l’attivazione [6, 7]. Questo è il
meccanismo per mezzo del quale si attivano anche le p21 ras, avviando la trasduzione
del segnale proliferativo [8].
L’espressione dei geni per i recettori LDL (i.e., HMGCoA-sintetasi ed HMGCoA-r)
ed altri regolatori della quantità di colesterolo (i.e., farnesil-difosfato-sintetasi e la
squalene-sintetasi), sono sotto il controllo di una famiglia di proteine legate alla
membrana del RE chiamate sterol regulatory element binding proteins (SREBP). Queste,
attivano i geni coinvolti nella sintesi ed uptake del colesterolo comportandosi come
fattori di trascrizione dopo scissione proteolitica [4] che è regolata dalla SREBP cleavage-
activating protein (SCAP), una proteina di membrana che funziona come sensore degli
steroli. La SCAP attiva la scissione delle SREBP e blocca la sua attività quando il
contenuto di steroli nel RE supera il valore soglia. Bassi livelli di colesterolo al contrario
porterebbero ad un’attivazione di SCAP ed aumento del cleavage di SREBP con
liberazione di un frammento di 68KDa trascrizionalmente attivo che, migrando nel
nucleo, si lega prevalentemente ai geni dell’HMGCoA-r e dell’HMGCoA-sintetasi,
attivandone l’espressione [9].
Inoltre, la via biosintetica del colesterolo richiede l’apporto di almeno 2
molecole di NADPH che, come è noto, è prodotto prevalentemente dalla via dello shunt
Introduzione – Il pathway del colesterolo
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dei pentoso fosfati, il cui enzima chiave è la glucose-6-phosphate dehydrogenase
(G6PD). La mancata disponibilità di NADPH, quindi, sarebbe un fattore che limita le
reazioni che portano alla formazione del colesterolo.
Internalizzazione delle LDL ed uptake
Normalmente è il fegato che provvede a rifornire i tessuti periferici di
colesterolo che, non essendo idrosolubile, è trasportato nel circolo dalle LDL che
vengono internalizzate dai tessuti periferici attraverso un meccanismo recettoriale [10].
Le LDL sono costituite da una parte centrale, composta prevalentemente da EC ed in
minor misura da trigliceridi (TG), e da un mantello esterno che le riveste costituito da
fosfolipidi, CL ed apolipoproteine B-100 (apoB-100).
Le LDL del siero sono captate dalle cellule previo legame con il recettore
specifico (R-LDL), una glicoproteina transmembrana che riconosce l’apoB-100, localizzato
in depressioni di membrana
caratterizzate dalla presenza
di clatrina. Queste si
invaginano formando delle
vescicole endocitiche (early
endosomes) che, percorrendo
la via endosomiale,
trasportano il complesso R-
LDL/LDL all’interno della
cellula (fig. 1). Il rivestimento
di clatrina ed i R-LDL rimossi migrano verso la superficie cellulare (recycling endosomes)
e le vescicole non rivestite, endosomi tardivi (late endosomes), si fondono con i lisosomi
formando gli endo-lisosomi (EL) (late endosome/lysosome hybrid). Qui, le lipoproteine
sono scisse nelle loro componenti per azione degli enzimi lisosomiali attivati
dall’abbassamento del pH. Il colesterolo che si libera dall’idrolisi degli EC è
immediatamente utilizzato per la sintesi di nuove membrane per il normale turnover e,
Fig. 1 – Internalizzazione delle LDL.
Introduzione – Il pathway del colesterolo
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quello in eccesso, viene trasportato al RE per essere esterificato ed accumulato nei LD,
oppure espulso dalle cellule.
Trasporto inverso del colesterolo
Per la maggior parte delle cellule l’efflusso del colesterolo, noto come trasporto
inverso del colesterolo [11], rappresenta l’unico meccanismo per liberarsi del CL
intracellulare in eccesso. Le HDL captano il CL esocitato dalle cellule dei tessuti periferici
e lo trasportano al fegato dove è eliminato attraverso la bile. Esse sono secrete dal
fegato o dall’intestino tenue come particelle discoidali nascenti, HDLn, per lo più
contenenti fosfolipidi ed apolipoproteine A-1 (apoA-1). La captazione ed il trasferimento
del colesterolo dalle cellule alle HDL avviene tramite il loro legame con il recettore
scavenger receptor-B1 (SR-B1), un membro della superfamiglia delle proteine CD36
presente sulla superficie cellulare [12]. Un'altra proteina di membrana che lega le HDL e
media l’efflusso cellulare del colesterolo è la ATP-binding cassette transporter-1 (ABCA1)
[13]. È interessante notare che l’SR-B1 e ABCA1 sono probabilmente concentrati nelle
caveole [14, 15], in una posizione tale da facilitare il trasferimento alle HDL del
colesterolo che arriva alle membrane dal RE. Il colesterolo, dunque, si trasferisce alle
HDLn e viene trasformato ad opera dell’enzima plasmatico lecithin-cholesterol
acyltransferase (LCAT) in EC che, in virtù della loro idrofobicità, migrano all’interno delle
particelle HDLn dando origine alle HDL mature.
Esterificazione ed idrolisi
Gli EC rappresentano la forma grazie alla quale il colesterolo viene
immagazzinato all’interno delle cellule, riducendo così il suo potere tossico e costituendo
una riserva di colesterolo rapidamente disponibile per le necessità cellulari [16]. Tale
riserva subisce continue idrolisi ed esterificazioni in quello che viene comunemente
indicato come ciclo degli esteri del colesterolo [17].
La formazione intracellulare di EC a partire da acidi grassi a lunga catena e CL è
assicurata da un enzima ATP-dipendente localizzato nelle membrane del RE, l’ACAT, la